LAS PLANTAS SIENTEN LA FUERZA I.

21 de Octubre de 2011.

Un científico de la WUSTL está aprendiendo cómo las plantas responden al sentido del tacto, la gravedad y otras fuerzas físicas.

Por: Diana Lutz.

"Imagínate ir de excursión por el bosque o caminar por el césped", dice Elizabeth Haswell, PhD, profesor asistente de biología en Artes y Ciencias en la Universidad Washington en St. Louis. "Ahora pregúntese: ¿Los arbustos saben que alguien los esta rozando? ¿El césped sabe que está siendo aplastado bajo los pies de alguien? Por supuesto, las plantas no piensan en este tipo de cosas, pero sí responden al ser tocadas en varias formas ".

Isabel Haswell, PhD, profesora asistente de biología en artes y ciencias, en una cámara de crecimiento con sus ",ratas de laboratorio", las plantas de Arabidopsis que utiliza para entender cómo las plantas responden al tacto, la gravedad y otras fuerzas mecánicas. Si plantas silvestres de Arabidopsis se tocan con frecuencia, su crecimiento se atrofia. Foto: David Kilper/WUSTL.

 "Está claro", dice Haswell, "que las plantas pueden responder a estímulos físicos, tales como la gravedad o el tacto. Las raíces crecen hacia abajo, una "planta sensible"pliega sus hojas, y una vid se enrosca en torno a un enrejado. Pero estamos empezando a saber cómo lo hacen ", dice.

En la década de 1980, el trabajo con células bacterianas mostraron que tienen canales mecanosensibles, pequeños poros en la membrana de la célula que se abren cuando la célula se hincha con el agua y la membrana se estira, dejando átomos cargados y otras moléculas salen rapidamente de la célula. Los iones salen con el agua , la célula se contrae, la membrana se relaja, y cierra los poros.

Los genes que codifican estos siete canales se han encontrado en la bacteria Escherichia coli y 10 en Arabidopsis thaliana, una pequeña planta con flores emparentada con la mostaza y la col. Tanto E. coli como Arabidopsis sirven como organismos modelo en el laboratorio de Haswell.
Ella sospecha que hay muchos más canales aún por descubrir y que le sirven para tener una amplia variedad de funciones.

Recientemente, Haswell y sus colegas del Instituto de Tecnología de California, que son co-principales investigadores en una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, por su sigla en inglés) para analizar canales mecanosensibles, escribió un artículo cuya revisión apareció el 11 de octubre en la emisión de "Estructura" (Structure).

El aumento de tamaño de las bacterias puede parecer no guardan relación con folíolos plegables, pero Haswell está dispuesta a apostar que están todos relacionados y que los canales iónicos mecanosensibles están en el fondo de todos ellos. Después de todo, los movimientos de las plantas - tanto rápidos como lentos - en última instancia, todos son accionados hidráulicamente, donde los iones van con el agua que saldrá.

Las células gigantes de E. coli.

El gran problema con el estudio de los canales iónicos ha sido siempre su pequeño tamaño, lo que plantea enormes retos técnicos.
Los primeros trabajos en campo, dan a entender que los canales iónicos son los que coordinan la apertura y cierre creando un impulso nervioso, se llevó a cabo en células excepcionalmente grandes: las células nerviosas gigantes del calamar de la Unión Europea, el cual tiene proyecciones lo suficientemente grandes como para ser visto a simple vista.

Los experimentos con estos canales eventualmente condujo al desarrollo de una técnica de grabación eléctrica sensible, conocida como la patch clamp ("sujetar con parche") que permitió a los investigadores examinar las propiedades de un único canal iónico. Grabación con patch clamp utiliza como electrodo una micropipeta de vidrio que tiene una punta abierta. La punta es lo suficientemente pequeña que encierra un "parche" de la membrana celular que contiene a menudo sólo uno o unos pocos canales de iones.

El trabajo con el patch clamp mostró que había muchos tipos diferentes de canales iónicos y que estaban involucrados no sólo en la transmisión de impulsos nerviosos, sino también con muchos otros procesos biológicos que involucran a los cambios rápidos en las células.

Los canales mecanosensibles fueron descubiertos cuando los científicos comenzaron a buscar los canales iónicos en las bacterias, que no fue sino hasta la década de 1980 debido a que los canales de iones se asociaron con los nervios y las bacterias no se cree que tienen un sistema nervioso.

En la E. coli, los canales iónicos están incrustados en la membrana plasmática, que se encuentra dentro de la pared celular, pero incluso si la pared pudiera ser despojada , las células son demasiado pequeñas para ser parcheadas de forma individual. Por lo que el trabajo se realiza con células bacterianas gigantes especialmente preparadas llamadas esferoplastos.

Ésto se hace mediante el cultivo de E. coli en un caldo que contiene un antibiótico que evita que las células hijas se separen por completo cuando una célula se divide. Como "serpientes" las células se multiplican, de muchas células que comparten una forma de membrana plasmática única en el cultivo. "Si entonces se digieren la pared celular, se hinchan para formar una esfera grande", dice Haswell.
No es que los esferoplastos sean tan grandes. "Estamos haciendo la mayoría de nuestros estudios en los ovocitos de Xenopus (huevos de rana), cuyos diámetros son 150 veces mayores que las de esferoplastos", dice.

Tres actividades de los canales mecanosensibles.

Para encontrar los canales iónicos en las bacterias, los científicos hicieron estudios electrofisiológicos de los esferoplastos. Metieron una pipeta en el esferoplasto y se aplicó succión a la membrana, ya que observaron unas pequeñas corrientes que fluyen a través de la membrana.
"Lo que encontraron fue realmente sorprendente", dice Haswell. "Hubo tres actividades diferentes que son salida (promueve la apertura), sólo por la deformación de la membrana." (Se les llama "actividades", porque nadie sabía de sus bases moleculares o genéticas todavía.)

Las tres actividades fueron llamadas, canales mecanosensibles de gran tamaño (MscL), pequeños (MscS) y mini (MscM) conductancia. Se distinguen entre sí por la cantidad de tensión que tuvieron que introducir con el fin de conseguir que se abran y su conductancia.

 Uno de los laboratorios que trabajan con esferoplastos fue dirigida por Ching Kung, PhD, de la Universidad de Wisconsin-Madison. La proteína del MscL fue identificada y su gen fue clonado en 1994 por Sergei Sukharev, PhD, entonces un miembro del laboratorio de Kung. Su experimento tour-de-force, dice Haswell, participan la reconstitución de las fracciones de la membrana plasmática de bacterias en las membranas sintéticas (liposomas) para ver si les confieren un gran canal de conductancia.

En 1999, el gen que codifica a el Mscs fue identificado en el laboratorio de Ian Booth, PhD, de la Universidad de Aberdeen. Comparativamente, el trabajo ha sido hecho en el canal pequeño, que es remilgado y, a menudo no se presenta, dice Haswell, a través de una proteína que contribuye a la actividad del MscM fue identificada recientemente por el grupo de Booth.

Una vez que ambos genes se conocieron, los investigadores realizaron experimentos destructivos para ver lo que le ocurrió a las bacterias que no tienen los genes necesarios para hacer los canales. Lo que encontraron, dice Haswell, fue que si los genes tanto del MscL y del MscS se pierden, las células no podrían sobrevivir a un "golpe bajo osmótico", el equivalente bacteriano de la tortura del agua.

"El ensayo estándar," dice Haswell , "es hacer crecer la bacteria durante un par de generaciones en un caldo muy salado, de manera que tengan la oportunidad de equilibrar su concentración osmolitica interna con el exterior." (los osmolitos son moléculas que afectan a la ósmosis, o el movimiento del agua dentro y fuera de la célula.) "Ellos hacen esto", dice ella, "tomando las osmolitos del medio ambiente y lo realizan por su propia cuenta."

"Entonces", dice ella, "usted toma estas bacterias que están repletas de osmolitos y las echa en agua dulce. Si no tienen las proteínas de los MscS y de los MscL que les permita deshacerse de los iones para evitar la entrada incontrolada de agua, ellos no sobreviven. "Es un poco como el verter peces de agua salada en un acuario de agua dulce.

¿Por qué hay tres actividades en un canal mecanosensible? El modelo actualmente aceptado, dice Haswell es que los canales con las conductancias más pequeñas son la primera línea de defensa. Abren temprano en respuesta al choque osmótico para que el canal de gran conductancia, a través del cual las moléculas que necesita la célula pueden escapar, no se abre a menos que sea absolutamente necesario. La respuesta gradual por lo tanto da a la célula su mejor oportunidad de sobrevivir.

Cristalización de las proteínas. 

El siguiente paso en esta odisea científica, es descubrir las estructuras de las proteínas, también fue muy difícil. Las estructuras de proteínas tradicionalmente se descubren mediante la purificación de una proteína, la cristalización de la misma sobre una solución de agua, y luego bombardear el cristal con rayos-X. Las posiciones de los átomos de la proteína se puede deducir a partir del patrón de difracción de los rayos-X.

En cierto sentido, la cristalización de una proteína no es tan diferente del crecimiento del caramelo de roca de una solución de azúcar, pero, como siempre, el diablo está en los detalles. Los cristales de proteínas son mucho más difíciles de conseguir que los cristales de azúcar y, una vez crecidos, son extremadamente frágiles. Incluso aunque pueden ser dañados por las sondas de rayos X utilizados para examinarlos.

Representaciones de la sección del poro del canal de MscS en E. coli en sus configuraciones de no conducción (arriba) y abierta (abajo) se basan en estudios de cristalización de rayos X de la estructura de la proteína. La transición entre los estados cerrado y abierto es a menudo descrito como similar a la reducción y la ampliación de la pupila del ojo. El estado "cerrado" aún puede parecer que tienen una abertura porque los aminoácidos en todo el acto de apertura como un "tapón hidrófobo" que impide que los iones se muevan a través de él.

Y para empeorar las cosas los MscL y los MscS atraviesan la membrana plasmática, lo que significa que sus extremos, que están expuestos a el periplasma afuera de la célula y el citoplasma dentro de la célula, son hidrofílicas y sus tramos medios, que están atrapados en la membrana grasosa, son repelidos por el agua. Debido a esta doble naturaleza es imposible precipitar proteínas de la membrana de las soluciones de agua.

En cambio, la técnica consiste en rodear la proteína con lo que se han caracterizado como "detergentes muy artificiales", que los protegen - pero por poco - desde el agua. Encontrar el equilibrio mágico puede llegar a tardar hasta una carrera científica.

El primer canal mecanosensibles a cristalizar fue el MscL - no la proteína en E. coli, pero la molécula análoga (un homólogo) de la bacteria que causa la tuberculosis. Este trabajo fue realizado en el laboratorio de uno de los co-autores de Haswell, Douglas C. Rees, un investigador Howard Hughes en el Instituto de California de tecnología. El tercer co-autor, Rob Phillips, también de Caltech.

El MscS de E. coli se cristalizó en el laboratorio Rees varios años más tarde, en 2002, y una proteína de MscS con una mutación que lo dejó atrapado en estado abierto se presumió fue cristalizado en el laboratorio de Booth en 2008. "Así que ahora tenemos dos estructuras cristalinas para el MscS y dos (a partir de diferentes cepas de bacterias) para el MscL", dice Haswell.

Continua. II parte.

Fuente: U. de Washington en San Luis.